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蛋白质定量88必发com

标签: 蛋白质 定量 蛋白质纯化指南 第八章

蛋白质定量88必发com主要用于测定蛋白质含量。

88必发com方法
  • 考马斯亮蓝蛋白质浓度分析法
  • 碱性铜还原分析法
  • 胺衍生法
88必发com方法原理

蛋白质分子中的芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基,其化学结构中的共轭双键,具有吸收紫外光的特性,吸收高峰在280 nm处,蛋白质溶液的吸光度(A280)与蛋白质含量成正比关系,可作为样品中蛋白质定量测定。该方法简便、灵敏、快速,且样品用量少且可回收,低浓度的盐类也不干扰测定,但测定的准确度比Lowry法低,这是由于对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差异较大的蛋白质时有一定的差距。若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质,会出现较大的误差。


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仪器、耗材
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(1) 准备 100~1500 ug/ml 的标准品, 溶于 Bradford 法相兼容缓冲液中。对于较稀的样品,可能通过增加样品在88必发com体积中的比率而扩大灵敏度(microBradfordassay:1~25ug/mL)。如果样品与染料的比值太高, 可能会增加反应混合物的 PH 而导致反应背景较高。

(2) 将标准品和待测样品加人到一次性的比色皿中 (应该使用一次性的塑料比色皿或微孔板,因为染料会黏附到各种材料容器的表面上)。

(3)Bradford 88必发com预热至室温。将 ImL 染料溶液加人到 25 uL 蛋白质样品中,混勻,室温孵育 10 min。

(4) 检测 450rnn 和 595nm 处的吸光度 (可以使用 570~610nm 的基于滤光器的仪器,对检测性能不会有明显的降低)。

(5) 对 595 nm 处的数据作图,或为提高在低反应值处的精度,对 595 nm/450 nm 的比率作图。标准反应曲线可以拟合为一个多项式反应,由此可以估算出待测样品的浓度值.
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注意事项

1. 测定液必须澄清,否则造成测定结果误差。


2. 由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH的改变而变化,故应用紫外吸收法时要注意溶液的pH,最好与制定标准曲线时的pH一致。


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碱性铜还原分析法 (Lowry 法)(Lowryetal.,1951) 和其他能够增强检测性能的方法都是基于一个包括两个步骤的过程。首先,双缩脲反应涉及蛋白质在碱性溶液环境中将铜还原(由 Cu2+到 Cu+); 随后是反应增强的阶段,Folin-Ciocalteu 88必发com (憐钼酸盐和憐钨酸盐)(PeterSon,1979) 被还原后产生一种在 750nm 处有最大吸光度的蓝色物质。这种检测方法因蛋白质序列的不同而有所变化,因为颜色的产生不仅取决于还原的铜-酰胺类复合物,而且还与酪氨酸、色氨酸有关,在较小的程度上还与胱氨酸、半胱氨酸、组氨酸残基等有关 (Peterson,1977;Wuetal.,1978)。

Lowry 法已经被改良以减少其对干扰物的敏感性、增加动态范围、缩短检测时间以及产生稳定的颜色生成物 (Peterson,1979)。有许多商业来源的改良 Lowry 法 (Roche、Pierce、Bio-Rad 和 Sigma),但不同的制剂可能不会得到相同的结果数据,即便是使用相同的标准品、稀释缓冲液或存在相同的干扰物质。

1.向 1 mL 含量为 5~100pg/mL 的一系列蛋白质标准品及该浓度范围内的待测样品中分别加入 ImL 碱性铜88必发com,混匀, 室温放置 10 min。

2.加人 0~5 mL Folin-Ciocalteu 88必发com混合物,祸旋使之充分混匀,孵育 30 min。

3.孵育完成后再次涡旋混匀,检测 750mn 处的吸光度。

吸光度的读取范围可以从 650~750nm, 这取决于可用的合适的滤光器 (酶标仪),或者,如果信号太强,不会对检测性能产生显著的影响。Lowry 法不是端点检测(endp0intassay),所以样品检测应该交错进行以获得更精确的测量值。

4.在有限的标准品浓度范围内观察到的反应将是线性的。可用多项式、指数和对数模型拟合数据以扩大反应曲线的动态范围。

上述的 Lowry 法可适应于微孔板,以减少所加人反应物的体积,产生的动态为 50~500 ug/mL。由于灵敏度、线性及方法学上的进步,Lowry 法已基本被 BCA 法所取代。

Lowry 法对许多干扰性化合物敏感 (表 8.1),对于这些物质可能不会产生线性反应 (因而导致要推断复杂的干扰数据)。去污剂、脂类、钾离子和磷酸钠的存在会导致沉淀产生。
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1.于分析前至少 30 min 将 15uL 2-巯基乙醇加人到 5 mL OPA 储存液中, 这一88必发com可稳定维持一天。所有荧光样品和相关反应在所有时间内都需要避光。

2.蛋白质标准品 (0.2~10 ug/mL) 和未知浓度的待测样品在分析前需要调节 pH 至 8.0?10.5。将 10 检测样品与 1 〇〇^xLOPA 储存液 (含 2-巯基乙醇) 混合,于室温下孵育 15 min。

3.加入 3 mL 0.5mol/L 的 NaOH, 混勻。

4.在激发光为 340nm, 发射光为 440~455nm 处,于荧光比色皿内对荧光进行读数。

5.在检测的动态范围内蛋白质浓度和荧光之间的联系应该是线性的,可以用来估计未知样品的浓度。

注释

相比基于吸光度的蛋白质定量分析方法,这 3 种染料都提供了更好的灵敏度和动态范围。由于染料在水溶液中的水溶性和稳定性更佳,所以 OPA 检测法普遍优于荧光胺检测法。

使用胺衍生88必发com对蛋白质进行定量具有一定的局限性,因为该检测方法显示出很大的蛋白质与蛋白质间的变异性,其原因是蛋白质中赖氨酸残基的数量不同,同时它需要一个「匹配」的标准品。该检测方法易被缓冲液中含有的甘氨酸、胺、铵离子和许多生物缓冲液中常见的硫醇所干扰,因而限制了它的应用(表 8.1)。检测的重复性取决于反应的 pH、蛋白质样品是否含有残余的酸性物质等。例如,来自于沉淀操作的样品,可减少胺的衍生率 (Youetal.,1997)。

一种非共价的胺活性染料—Epicocconone,也可用于溶液中总蛋白质量的检测 (Sigma),这一方法的机制已有报道 (BellandKaruso,2003;Coghlanetal.,2005)。

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    solonye

    3个月前 觉得简单

    蛋白质的传功定量88必发com很简单,但是也很重要,可以解决绝大部分的88必发com和需求。但是目前越来越多的定量蛋白质组88必发com,一般的定量已经达不到要求了,比如说DIGE和iTRAQ等88必发com,上样量精确到0.几个微克,所以需要用到QUBIT等专门的定量仪器并结合88必发com盒

  • 88必发com_lilinling203

    lilinling203

    3个月前 觉得很简单

    做的并不好

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